Определена зависимость физико-химических свойств порошка гидроксиапатита от способа его получения. Изучены образцы материалов, полученных из биологического сырья путем обжига и деминерализации костей крупного рогатого скота. Исследована поверхность порошков гидроксиапатита методом растровой электронной микроскопии, получены гистограммы распределения частиц по размерам и величины площади удельной поверхности. Установлен фазовый состав исследуемых материалов методом рентгенофазового анализа. Определен способ, позволяющий получать ультрадисперсный

порошок гидроксиапатита с регулируемым размером частиц и с соотношением элементов Сa/P, наиболее близким к стехиометрическому в костной ткани. Показано, что наилучшими физико-химическими свойствами с точки зрения практического применения в медицине обладают порошки гидроксиапатита, полученные методом деминерализации костей крупного рогатого скота растворами хлороводорода с концентрациями 1 М и 2 М. Эти порошки имеют наименьшие размеры частиц и большую величину площади удельной поверхности.

Ключевые слова: гидроксиапатит, рентгенофазовый анализ, метод внутреннего стандарта, фазовый состав, стехиометрический состав, растровая электронная микроскопия.

Одной из актуальных проблем в современной медицине является регенерация поврежденных участков органов и тканей с максимально полным

и быстрым восстановлением их структуры и функциональных характеристик. Порошок гидроксиапатита (ГА), широко применяемый в настоящее

время в регенеративной медицине и косметологии, имеет различную структуру и морфологию поверхности в зависимости от способа его получения и

является нетоксичным, биодеградируемым и совместимым с тканями человеческого организма.

В работах [1, 2] представлены результаты исследования процесса остеоинтеграции имплантов с нанесенным покрытием на основе ГА, при этом было установлено, что биологическая эффективность покрытий в значительной степени определялась морфологией поверхности покрытий и соотношением активных элементов в исходном порошке. Для максимальной эффективности материала и исключения риска негативных реакций иммунной системы реципиента необходимо, чтобы стехиометрический состав порошка ГА, в частности, отношение элементов Са/Р, было максимально приближено к составу костной ткани и составляло 1,65 – 1,67.

В настоящее время существует множество методик получения ГА различной степени дисперсности, например: смешение суспензии гидроксида кальция с ортофосфорной кислотой [3], прокаливание оксида кальция и смешение его с диаммоний фосфатом [4], осаждение из водных солей кальция и фосфора с использованием ЭДТА [1]. Однако существенными недостатками этих способов является длительность и многостадийность предлагаемых процессов, а также низкий выход конечного продукта и отличие стехиометрического состава получаемого ГА от естественного соотношения в костной ткани.

В работе [5] подробно описан процесс получения порошка ГА из нитрата кальция и гидрофосфата аммония, при этом конечный продукт имеет соотношение элементов Са/Р — 1,48, 1,61 и 1,67. Отмечено, что минимальный размер зерен ГА, полученного таким способом, составляет не менее

100 нм. Для уменьшения размеров частиц и увеличения площади удельной поверхности ГА дополнительно предложены методы плазменной обработки

[6, 7], СВЧ-обработки [8] и денотационно-газового напыления [9]. В работе [10] исследован метод ультразвуковой обработки ГА, позволяющий улучшить характеристики структуры порошка, в том числе, морфологию поверхности.

В связи с этим, неоспоримым преимуществом биологического ГА, произведенного деминерализацией или обжигом костей крупного рогатого скота

(КРС), является возможность получения материала с регулируемым размером частиц, с максимально приближенным к естественному стехиометрическим составом и сбалансированным микроэлементным составом. Кроме того, метод отличается простотой аппаратурного оформления и более высокой производительностью.

Цель данной работы — определение оптимального способа получения порошка ГА с наилучшими физико-химическими характеристиками, сравнение свойств порошков ГА, полученных методом деминерализации и методом обжига, по следующим параметрам: морфология поверхности, площадь удельной поверхности, размеры частиц порошков, стехиометрическое соотношение Са/Р, фазовый состав.

Образец порошка ГА № 1 был получен методом обжига [11] по следующей схеме: очищенные и обезжиренные кости КРС измельчали до размеров 2 – 5 см во всех трех измерениях, затем промывали водой при температуре 40 – 45 °С, укладывали в один равномерный слой тощиной 1,5 – 2 см на огнеупорную фарфоровую подложку и помещали в муфельную печь. При подаче инертного газа (азота) осуществляли контролируемый подъем температуры до 800 °С и выдерживали материал при данной температуре в течение 1,5 – 2 ч до получения порошка белого цвета. После выключения и охлаждения печи продукт извлекали, промывали бидистиллированной водой и измельчали в фарфоровой ступке.

Образцы порошков ГА № 2 – 5 были получены следующим способом: кости КРС механически очищали от мягких тканей, измельчали до размеров 2 – 5 см во всех трех измерениях, промывали тводой при температуре 40 – 45 °С и помещали в водные растворы хлороводорода с концентрацией 1 М, 2 М, 3 М, 4 М — образцы № 2 – 5, соответственно. По завершении деминерализации полученные растворы отфильтровывали. ГА осаждали из фильтратов добавлением концентрированного раствора гидроксида аммония при постоянном перемешивании. Процесс осуществляли до достижения значения pH реакционной среды 7,3 – 7,5, при котором отмечали усиленное образование осадка в виде плотной, непрозрачной белой взвеси. Затем взвесь фильтровали, и полученный осадок многократно промывали дистиллированной водой до значения рН промывных вод 6,0 – 6,5, 4 – 5 раз обрабатывали слабым раствором карбамида для удаления соосадившихся костных белков, выкладывали ровным слоем толщиной не более 1 см на эмалированную подложку, высушивали при температуре не более 100 °С и измельчали в фарфоровой ступке.

В целом процессы деминерализации костей КРС и осаждения ГА можно описать следующими уравнениями реакций:

Са3(РО4)2 + 6 НCl = 3 CaCl2 + 2 H3PO4, (1)

10 CaCl2 + 6 H3PO4 + 20 NH4OH = Ca10(PO4)6(OH)2 + 20 NH4Cl + 18 H2O. (2)

Исследования морфологии поверхности полученных порошков ГА проводили методом растровой электронной микроскопии (РЭМ) с помощью

растрового электронного микроскопа Philips SEM 515 (“Philips”, Нидерланды) с приставкой для энергодисперсионного анализа.

Удельную поверхность частиц ГА определяли многоточечным методом БЭТ (Брунауэра – Эммета – Теллера) с помощью анализатора удельной поверхности Сорбтометр-М с диапазоном измерения удельной поверхности 0,5 – 600 м2/г и относительной погрешностью измерений не более 6 %

согласно стандартам ASTM D3663, ASTM D4820, ASTM D1993. Метод был основан на измерении адсорбционных характеристик образца и построении изотермы адсорбции в диапазоне парциальных давлений газа-адсорбата от 0,02 до 0,95 с использованием высокоточной системы дозирования эталонных газовых объемов.

Определение концентрации анализируемых химических элементов и их распределение в составе полученных образцов осуществляли методом рентгеновского электронно-зондового микроанализа на рентгеновском электронно-зондовом микроанализаторе INKAEnergy 200 (“Oxford Instruments

Analytical”, Великобритания), смонтированном на сканирующем микроскопе JSM-840 (“JEOL”, Япония), при ускоряющем напряжении 20 кэВ и рабочем расстоянии 15 мм.

Фазовый состав образцов исследовали рентгенодифрактометрическим методом на рентгеновском дифрактометре Shimadzu XRD 7000, предназначенном для стандартного рентгеноструктурного анализа поликристаллических материалов.

Фазы идентифицировали с помощью базы данных PDF-4. Измерения проводили методом внутреннего стандарта [12]. Положения пиков и их интенсивности обрабатывали с помощью программного обеспечения XRD-7000 DPS.

Подготовку проб осуществляли методом квартования. Во всех экспериментах использовались реактивы со степенью чистоты ч.д.а. Все измерения проводили пять раз, результаты пяти измерений усредняли. Результаты измерений являются воспроизводимыми и представлены с доверительной вероятностью 95 %.

В ходе работы исследованы образцы порошков № 2 – 5, полученные деминерализацией костей КРС водными растворами хлороводорода с концентрацией 1 М, 2 М, 3 М и 4 М, соответственно. Использование растворов хлороводорода более высокой концентрации приводит к полному растворению КРС и загустеванию растворов, тем самым, затрудняя дальнейшие операции фильтрования [13]. Микрофотографии поверхности образцов № 2 – 5 представлены на рис. 1.

Микрофотография поверхности частиц порошка ГА (образец № 1), полученного методом обжига, представлена на рис. 2.

По результатам РЭМ образцы порошков ГА, полученные методом деминерализации КРС, представляют собой порошкообразную смесь агломератов

размером до 400 мкм, состоящих из зерен размером 10 – 15 нм. Порошок ГА, полученный методом обжига, представлен более мелкими агломератами (до

5 мкм), состоящими из частиц большего размера (до 50 нм). Частицы образца № 1 имеют более сглаженную структуру, а частицы образца №5 — более

рыхлую. Это подтверждается результатами исследований распределения частиц ГА по размерам с помощью метода случайных секущих изображений РЭМ.

Гистограммы распределения частиц по размерам приведены на рис. 3.

Результаты исследований показали, что размеры частиц увеличиваются с повышением концентрации раствора хлороводорода. В образце № 2 пики гистограммы локализованы в диапазоне до 12 нм, в этом интервале находится до 70 % частиц от общего количества. В образце № 5 средний размер частиц существенно выше, и пики гистограммы локализованы в диапазоне 18 – 30 нм, в этом интервале сосредоточено до 65 % частиц от общего количества. Во всех случаях наблюдаются вытянутые “хвосты” в сторону больших размеров. Гистограмма распределения частиц образца №1, полученного методом обжига, показывает, что до 65 % частиц находится в диапазоне 30 – 42 нм.

Результаты исследования удельной поверхности порошков ГА, представленные в табл. 1, показали, что наименьшую величину площади удельной поверхности (6 м2/г) имеет образец № 1, а для образцов № 2 – 5 величина площади удельной поверхности уменьшается с увеличением концен-

трации раствора хлороводорода. При этом наибольшую площадь удельной поверхности имеют образцы № 2 и № 3 (72 и 70 м2/г, соответственно).

Результаты энергодисперсионного анализа показали, что основными элементами в составе ГА являются кислород, кальций и фосфор, примеси

других элементов, нехарактерных для ГА, не обнаружены. В полученных образцах определены отношения атомных концентраций кальция и фосфора.

По результатам элементного анализа, представленным в табл. 2, можно судить о степени стехиометричности полученных материалов. Наиболее

близкое к стехиометрическому соотношение Ca/P, равное 1,64 и 1,67, имеют образцы № 2 и № 3, полученные методом деминерализации КРС. Образец № 1 получен с дефицитом ионов кальция и стехиометрическим соотношением Са/Р, составляющим 1,36. С помощью рентгенофазового метода анализа установлено, что образцы № 2 – 5, полученные методом деминерализации КРС, представляют собой на 99 % гетерофазную смесь кристаллов ГА

гексагональной и моноклинной модификации. При этом образец ГА № 1, полученный методом обжига, на 100 % представлен кристаллической фазой.

Результаты рентгенофазового анализа приведены в табл. 3.

Таким образом, отличительной особенностью предложенного метода деминерализации КРС в сравнении с существующими методиками является

возможность получения порошка ГА, представленного не менее чем на 99 % кристаллической фазой, с заданным стехиометрическим составом, распределением частиц по размерам и величиной удельной поверхности без применения энергоемкой многостадийной обработки поверхности ГА.

Исследованы образцы порошков гидроксиапатита, полученные различными способами и проведен их сравнительный анализ. Показано, что наилучшими физико-химическими свойствами с точки зрения практического применения в медицине обладают порошки гидроксиапатита, полученные методом деминерализации костей крупного рогатого скота растворами хлороводорода с концентрациями 1 М и 2 М. Эти порошки имеют наименьшие размеры частиц до 30 нм и большую величину площади удельной поверхности до 72 м2/г. Данный способ позволяет получать порошки гидроксиапатита со стехиометрическим соотношением Са/Р = 1,64 – 1,67, что является наиболее близким к естественному соотношению этих элементов в костной ткани человека. Гидроксиапатит, полученный методом обжига, имеет дефицит кальция и соотношение Са/Р равно 1,36.

Работа проводилась в рамках Федеральной целевой программы “Научные и научно-педагогические кадры инновационной России” на 2009 – 2013 год по мероприятию 1.2.1 “Проведение научны х исследований научными группами под руководством докторов наук” по направлению “Создание и обработка композиционых керамических материалов” по проблеме “Создание и исследование новых композиционных керамических материалов с улучшенными свойствами для медицины и ядерной промышленности”, гос. контракт № П 414.

1. Гузеева Т.И., Гузеев В.В., Леонова Л.А. и др. Получение порошка гидроксиапатита в ходе жидкофазного синтеза. Известия Томского политехнического университета, 2009, т. 315, № 3, с. 47 – 50.

2. Kuzmanin S.A., Nazarov E.A., Papkov V.G. Morphological picture of the interaction of a composite material of calcium phosphate and germanium with bone tissue

in the experiment. Modern problems of science and education, 2016, no. 3, pp. 25 – 32.

3. Комаров В.Ф., Мелихов И.В., Рудин В.Н., Орлов А.Ю., Минаев В.В., Зуев В.П., Божевольнов В.Е. Способ получения гидроксиапатита. Патент РФ № 2077475. Заявка 93012609/25 от 09.03.1993, опубл. 20.04.1997.

4. Орловский В.П., Родичева Г.В., Ежова Ж.А., Суханова Г.Е., Коваль Е.М., Романова Н.М. Способ получения гидроксиапатита кальция. Патент РФ

№ 1834836. Заявка 5013838/26 от 26.11.1991, опубл. 15.08.1993.

5. Сафронова Т.В., Путляев В.И., Авраменко О.А. и др. Порошок Са-дефицитного гидроксиапатита для получения керамики на основе трикальцийфосфата.

Стекло и керамика, 2011, № 1, с. 27 – 31.

6. Мельникова И.П., Лясникова А.В., Лясников В.Н. Морфология частиц гидроксиапатита и ее влияние на свойства биокомпозитных плазмонапыленных

покрытий. Саратовский научно-медицинский журнал, 2013, т. 9, № 3, с. 441 – 445.

7. Мельникова И.П., Лясникова А.В., Лясников В.Н. Улучшение функциональных характеристик биосовместимых плазмонапыленных покрытий медицинских имплантатов путем повышения равномерности их пористой и стабилизации кристаллической структур. Биотехносфера, 2012, № 5 – 6,

с. 56 – 61.

8. Рассказова Л.А., Коротченко Н.М. Сравнение свойств различных ионзамещенных гидроксиапатитов, полученных по СВЧ-технологии. Вестник Кузбасского государственного технического университета, 2013, № 2, с. 88 – 91.

9. Ситников А.А., Яковлев В.И., Тубалов Н.П. и др. Подготовка исходного порошка гидроксиапатита кальция для денотационно-газового напыления на

титановую основу. Ползуновский вестник, 2012, т. 1, № 1, с. 269 – 272.

10. Джераян Т.Г., Ванифатова Н.Г., Фадеева И.В. и др. Влияние прекурсоров и ультразвуковой обработки на морфологию частиц гидроксиапатита с

использованием капиллярного зонного электрофореза. Журнал аналитической химии, 2015, т. 70, № 5, с. 524 – 530.

11. Шпилевская Л.Е., Морозова А.А., Старовойтов А.А., Морозов В.Е. Способ получения гидроксиапатита. Патент респ. Беларусь № 3656. Заявка 960207 от

26.04.1996, опубл. 30.12.2000.

12. Тушинский Л.И. Методы исследований материалов: структура, свойства и процессы нанесения неорганических покрытий. М.: Мир, 2004, 384 с.

13. Зеличенко Е.А., Гузеев В.В., Рогулина А.С., Гурова О.А., Ковальская Я.Б. Исследование свойств гидроксиапатита, выделенного из костной ткани

сельскохозяйственных животных. Химия в интересах устойчивого развития, 2012, № 5, с. 543 – 548.